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基因治疗大规模质粒工艺开发策略
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基因治疗大规模质粒工艺开发策略
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2022-6-21 19:41:54
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质粒DNA能够广泛用于基因细胞治疗和核酸药物领域。
如图所示,质粒包裹在宿主菌/大肠杆菌中,中间的一小部分就是质粒DNA。
质粒生产
从结构上看,质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。除了酵母的杀伤质粒是RNA质粒外,迄今为止所有的质粒无一例外都是属于这种类型的DNA分子。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。
为了更好地适应细胞的生理特点,质粒主要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型:超螺旋质粒DNA;开环质粒DNA和线性质粒DNA分子。
质粒DNA大部分都是双链超螺旋的闭合环状,少数是线性化的,且具有可转移性、可整合性,以及拷贝数,后者分为松弛型和严紧型两种状态。
2
质粒工艺开发策略
常见的质粒工艺的主要流程包括载体构建、发酵培养、碱裂解、澄清/浓缩、RNA层析、SC DNA层析、精纯,以及浓缩置换。
1
载体构建
载体构建主要分为四部分:复制原点的选择、抗性基因的选择、调控序列的选择以及目的基因的选择。
首先是复制起点的选择。为了提高质粒DNA的产量,通常会选择含Col EI复制原点的高拷贝质粒。携带ColE1复制子的质粒中,RNA II复制是正向的调节分子,RNA I是复制的负调节物。同时,质粒编码的一种Rop/Rom蛋白蛋白可以调节RNA I和RNA II的结合效率,起到增强RNA负调控的作用。我们发现,Rop/Rom基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高3至4倍。
其次是抗性基因的选择。在选择抗性基因时,由于极少量即可引起部分人群强烈的过敏反应,首先应避免β-内酰胺类抗生素的使用。
在调控序列部分,构建质粒DNA需要考虑控制目的基因在真核细胞中高效和稳定表达的启动子和终止信号等的调控序列。
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